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高效液相色谱仪测定灵芝中活性成分含量
发布时间:2019-09-24 09:44  | 作者: admin  | 来源: 未知
高效液相色谱仪测定灵芝中活性成分含量



灵芝子实体中主要含有三萜类、多糖及蛋白质等活性成分 。灵芝也含有真菌类的特征成分麦角甾醇。本文采用紫外分光光度法和高效液相色谱仪分别测定这4类活性成分。
 
1、仪器与试剂 
高效液相色谱仪配紫外检测器;
 
紫外可见分光光度计;
 
电恒温水浴锅;
 
电子分析天平:0.1mg;
 
​超声波清洗机;
 
高速离心机;
 
D-葡萄糖、熊果酸、牛血清蛋白对照品、麦角甾醇对照品;
 
​酚蛋白定量试剂盒,5% 香草醛-冰乙酸,苯酚,无水乙醇、丙酮、浓硫酸(分析纯),乙腈(色谱纯)。
 
​供试样品 :不同品种的灵芝样品采集或购买。
 
2、总多糖含量测定
2. 1 供试品溶液的制备 称取灵芝子实体干燥粗粉 1 g,精密称定,置圆底烧瓶中,加入 80% 的无水乙醇 100 mL,85 ℃ 回流提取 2 次,每次 0. 5 h,过滤弃去滤液,加蒸馏水 100 mL,100 ℃ 回流提取 2次,每次 1 h,过滤,合并滤液,定容至 250 mL 量瓶中,摇匀,即得。
 
2. 2 对照品溶液的制备
 
精密称取干燥至恒重的 D-无水葡糖糖对照品 10. 0 mg 于 100 mL 量瓶中,加蒸馏水配制成 0. 10 g·L-1 的对照品溶液,置冰箱中备用。
 
2. 3 标准曲线的绘制 
 
精密吸取葡萄糖对照品溶液 0. 3,0. 6,0. 9,1. 2,1. 5,1. 8 mL 分别置于具塞试管中,加蒸馏水至 2. 0 mL,摇匀后置冰浴中加入5% 的苯酚溶液 1 mL、浓硫酸溶液 5 mL,摇匀,静置5 min,于沸水浴中加热 15 min,冷却至室温,以蒸馏水 2. 0 mL 为空白,同法操作,于 490 nm 波长处测定其吸光度 。以质量浓度(C)为横坐标,A 为纵坐标绘制标准曲线。
 
2. 8 样品含量测定 
 
分别取样品,按 2. 1. 1制备供试品溶液,平行 3 份。精密吸取 2 mL 至试管中,按 2. 1. 3 测定其吸光度。
 
3、总三萜含量测定
3. 1 供试品溶液的制备 
 
称取灵芝子实体干燥粗粉 1 g,精密称定,置圆底烧瓶中,加入无水乙醇50 mL 浸泡 1 h 后回流 2 h,放冷后补足差重,过滤、取续滤液,即得。
 
3. 2 对照品溶液的制备 
 
精密称取干燥至恒重的熊果酸对照品 10. 0 mg 置 50mL量瓶内,加无水乙醇配制成 0. 2 g·L- 1的对照品 溶 液,置 冰 箱中备用。
 
3. 3 标准曲线的绘制 
 
精密吸取熊果酸对照品溶液 0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0,1. 2 mL 分别至试管中,100 ℃ 水浴蒸干后加入 5% 的香草醛-冰醋酸溶液0. 5 mL,摇匀,加入高氯酸溶液 0. 8 mL,60 ℃ 水浴20 min,取出后于冰浴中加入冰乙酸 5 mL,摇匀,室温放置 15 min。以无熊果酸对照品溶液的试管为空白,同法操作,于 548 nm 条件下测定吸光度。以熊果酸质量(X) 为横坐标,吸光度(Y) 为纵坐标绘制 标 准 曲 线。
 
3. 4 样品含量测定 
 
分别取样品,按制备供试品溶液,平行3份。精密吸取 0. 5 mL至试管中,测定其结果。
 
4、 蛋白质含量测定
4. 1 供试品溶液的制备 
 
称取灵芝子实体干燥粗粉 1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入蒸馏水100 mL,超声提取 10 min,补足差重,摇匀,过滤取续滤液适量,于离心管中以 8 000 r·min- 1 离心 15 min,取上清液,即得。
 
4. 2 对照品溶液的制备 
 
精确称量牛血清蛋白对照品 5 mg,配成质量浓度为 0. 25 g·L- 1的牛血清蛋白对照品溶液,置冰箱中备用。
 
4. 3 标准曲线的绘制 
 
精密吸取对照品溶液0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0 mL 于试管中,加蒸馏水至 1 mL,摇匀。分别在试管中加入试剂盒中的试剂甲 5 mL,摇匀,于室温放置 10 min;加入试剂乙 0. 5mL,立即摇匀,于室温保温 30 min 后于 750 nm 波长处测定其吸光度。以 1 mL 蒸馏水为空白,同法操作。以蛋白质质量浓度为横坐标(C),吸光度为纵坐标(A)绘制标准曲线。
 
4. 4 样品含量测定
 
分别取样品,按制备供试品溶液,平行3 份。精密吸取 1. 0 mL 至试管中,测定其吸光度值,计算结果。
 
5、麦角甾醇含量测定 
灵芝子实体中麦角甾醇含量测定采用高效液相色谱仪,色谱柱为C18 (4. 6mm × 250mm,5 μm),流动相 100% 甲醇,流速 0. 8mL·min- 1 ,检测波长 282 nm 。对照品和供试品色谱图见图 1。